近日，JIPB發(fā)表了南京農(nóng)業(yè)大學(xué)萬(wàn)建民院士團(tuán)隊(duì)題為“Engineer the eukaryotic OMEGA?Fanzor systems for genome editing in plants”的研究論文。該研究利用單個(gè)轉(zhuǎn)錄單元（Single transcript unit, STU）策略開(kāi)發(fā)出適用于植物的高效OMEGA?Fanzor基因組編輯系統(tǒng)，并在水稻再生植株中實(shí)現(xiàn)了最高50.0%的編輯效率，為植物育種技術(shù)和功能基因研究提供了新工具。

作為CRISPR系統(tǒng)的祖先，OMEGA同樣是RNA引導(dǎo)（ωRNA）的可編程的核酸酶系統(tǒng)，主要包含IscB、IsrB、TnpB和Fanzor等。其中，真核生物來(lái)源的Fanzor蛋白與原核生物來(lái)源的TnpB為同源蛋白，其核酸酶特性與Cas12蛋白類(lèi)似，大小僅為Cas12a蛋白的一半（平均～620 aa），但其在植物基因組中難以實(shí)現(xiàn)有效的基因編輯。

本研究首先構(gòu)建了基于pCAMBIA1300骨架的STU載體，與需要核酶介導(dǎo)sgRNA成熟的Cas9-STU系統(tǒng)不同，F(xiàn)anzor-STU系統(tǒng)因其Fanzor蛋白能夠加工自身mRNA以生成功能性ωRNA而省略了核酶。研究團(tuán)隊(duì)在水稻原生質(zhì)體中測(cè)試了4種Fanzor蛋白的活性，其中NlovFz2效率為2.8%，其次是SpuFz1和MmeFz2的效率分別為1.4%和0.9%，而GtFz1幾乎未檢測(cè)到活性（圖1）。隨后，團(tuán)隊(duì)在小麥原生質(zhì)體中進(jìn)行了活性測(cè)試，結(jié)果顯示NlovFz2和SpuFz1分別在TaDEP1靶點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了2.9%和1.0%的編輯效率，表明了Fanzor-STU載體構(gòu)建策略在不同的作物中均能適用。

圖1 OMEGA-Fanzor系統(tǒng)在水稻和小麥原生質(zhì)體中的活性測(cè)試

此外，研究團(tuán)隊(duì)采用AlphaFold3對(duì)NlovFz2的結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)NlovFz2蛋白N端存在一個(gè)含有類(lèi)NLS信號(hào)的無(wú)序區(qū)域。為了驗(yàn)證無(wú)序序列對(duì)編輯效率的影響，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了四種截短類(lèi)型的NlovFz2-STU載體，并通過(guò)N端帶有或不含SV40 NLS來(lái)驗(yàn)證預(yù)測(cè)類(lèi)NLS的功能是否能被替代。與對(duì)照3.3%的編輯效率相比，Nlov-Del.v1（402 aa）和Nlov-Del.v2（387 aa）的效率均有所降低，分別為0.9%和1.7%，而N端添加了SV40 NLS的Nlov-Del.v3（403 aa）效率也僅為1.7%；在將預(yù)測(cè)的NLS替換為SV40 NLS后，效率恢復(fù)到2.7%，且與未截?cái)鄬?duì)照相比無(wú)顯著差異（P=0.7000），而pH-NlovFz2-STUΔbpNLS在刪除STU載體C端的bpNLS后，活性則徹底喪失（圖2）。

圖2 NlovFz2無(wú)序區(qū)域不同截?cái)嘧凅w對(duì)編輯效率的影響

研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系，檢測(cè)了OMEGA-Fanzor系統(tǒng)在栽培種寧粳7號(hào)中的編輯效率。結(jié)果顯示，NlovFz2的編輯效率最高（22.5%-50.0%），隨后是SpuFz1（24.8%-34.6%）和MmeFz2（17.8%-18.8%），且編輯事件均為2-36 bp的DNA小片段刪除。其中，NlovFz2成功在編碼水稻八氫番茄紅素脫氫酶OsPDS的第13外顯子靶點(diǎn)處產(chǎn)生編輯，并得到了具有白化表型的突變植株（圖3）。

該研究首次在植物中系統(tǒng)評(píng)估并優(yōu)化了真核來(lái)源的OMEGA-Fanzor系統(tǒng)，其中NlovFz2表現(xiàn)出色，具備體積?。?89 aa）、效率高、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。STU策略的運(yùn)用使其更適合病毒介導(dǎo)的基因編輯（VIGE）和多基因編輯系統(tǒng)構(gòu)建，未來(lái)通過(guò)ωRNA和蛋白工程進(jìn)一步優(yōu)化，有望豐富現(xiàn)有的基因編輯工具箱，為作物育種和功能基因研究提供新工具。

圖3 OMEGA-Fanzor系統(tǒng)在水稻再生植株中的編輯

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)博士生紀(jì)元、孫巖和已畢業(yè)碩士生周賀杰為共同第一作者，萬(wàn)建民院士和李超教授為共同通訊作者。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)董小鷗教授和中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所王延鵬研究員等也參與了部分研究工作。該研究得到國(guó)家生物育種重大專(zhuān)項(xiàng)、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、生物育種鐘山實(shí)驗(yàn)室和南京農(nóng)業(yè)大學(xué)三亞研究院引導(dǎo)項(xiàng)目等資助。

論文鏈接：https://doi.org/10.1111/jipb.70049