近日，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)萬(wàn)建民院士團(tuán)隊(duì)通過(guò)蛋白質(zhì)工程設(shè)計(jì)，開(kāi)發(fā)了一類(lèi)高效、高特異性的“嵌合高保真Cas9蛋白”形式的腺嘌呤堿基編輯工具CH-ABE及其PAM-less變體，在水稻中實(shí)現(xiàn)了高效和高特異性兼具的精準(zhǔn)單堿基編輯，該研究成果于2025年12月23日在線(xiàn)發(fā)表于植物學(xué)知名期刊Plant Biotechnology Journal上。

新型精準(zhǔn)堿基編輯工具CH-ABE開(kāi)發(fā)與應(yīng)用

在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生物育種技術(shù)領(lǐng)域，腺嘌呤堿基編輯器（ABEs）因其能實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的A-to-G的單堿基替換且不產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，成為作物遺傳改良的重要工具。然而，ABE8e使用了高活性的TadA8e脫氨酶，引發(fā)了其在全基因組范圍內(nèi)產(chǎn)生脫靶的安全擔(dān)憂(yōu)。

研究團(tuán)隊(duì)采用了“嵌入式”策略，將高活性的TadA8e蛋白“鎖”在Cas9蛋白的特定柔性區(qū)域，篩選開(kāi)發(fā)出4個(gè)CP-ABE版本，顯著抑制sgRNA非依賴(lài)的脫靶編輯。進(jìn)一步引入高保真Cas9蛋白（SniperCas9、eSpCas9(1.1)和Sniper2L），構(gòu)建了CH-ABE編輯系統(tǒng)，將sgRNA依賴(lài)性和非依賴(lài)性的脫靶效應(yīng)分別降低了高達(dá)7.0倍和79.4倍，并能夠產(chǎn)生22.0%-72.4%的水稻純合及雙等位突變體。全基因組和全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（WGS/WTS）進(jìn)一步證實(shí)了CH-ABEs在安全性方面的優(yōu)化。

為擴(kuò)大其靶向范圍，研究團(tuán)隊(duì)還開(kāi)發(fā)了3種無(wú)PAM限制的SpRY變體（SpRY-K1，SpRY-K2和SpRY-KK），將CP-ABE在非經(jīng)典PAM靶點(diǎn)處的活性提升了80.0%。利用優(yōu)化的編輯器CP-ABE8e-RY^KK，團(tuán)隊(duì)成功區(qū)分了水稻中的旁系同源靶點(diǎn)（OsSPL14與OsSPL16），并通過(guò)精確安裝OsALS-K591E突變創(chuàng)制了抗除草劑水稻種質(zhì)（圖1）。相關(guān)研究為優(yōu)良等位變異的定向精準(zhǔn)創(chuàng)制以及分子設(shè)計(jì)育種提供了技術(shù)支撐。

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀博士生胡健健、李雪和已畢業(yè)碩士生高渝鴻為本文共同第一作者，萬(wàn)建民院士和李超教授為共同通訊作者。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)董小鷗教授、吳玉峰教授、王益華教授、趙志剛教授和劉世家研究員等參與部分研究工作。該研究得到國(guó)家生物育種重大專(zhuān)項(xiàng)、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、生物育種鐘山實(shí)驗(yàn)室和南京農(nóng)業(yè)大學(xué)三亞研究院等引導(dǎo)項(xiàng)目等資助。

原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.70511