近日，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院百合科研團(tuán)隊(duì)滕年軍、吳澤課題組在《Plant Biotechnology Journal》雜志上在線(xiàn)發(fā)表了論文“Lily Transcription Factors LlPLATZ1 and LlMYB4 Orchestrate the Homeostasis of Heat Stress Responses via Antagonistic Regulation ofLlHSF24”。

本研究鑒定出百合中一個(gè)熱誘導(dǎo)的PLATZ轉(zhuǎn)錄因子家族成員——LlPLATZ1。LlPLATZ1受高溫快速誘導(dǎo)，其蛋白定位于細(xì)胞核，并具有轉(zhuǎn)錄抑制活性。LlPLATZ1可與B類(lèi)熱脅迫轉(zhuǎn)錄因子基因LlHSF24的啟動(dòng)子結(jié)合，從而抑制其表達(dá)。在百合中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)LlPLATZ1可增強(qiáng)其耐熱性，但抑制其生長(zhǎng)；而沉默LlPLATZ1會(huì)導(dǎo)致LlPLATZ1會(huì)導(dǎo)致百合耐熱性降低。進(jìn)一步分析表明，LlHSF24直接抑制熱保護(hù)基因LlHSP22.0和LlHSP70的表達(dá)，從而削弱耐熱性。此外，LlPLATZ1與LlMYB4互作，后者是一個(gè)長(zhǎng)期高溫誘導(dǎo)的MYB轉(zhuǎn)錄因子，其通過(guò)與LlHSF24啟動(dòng)子結(jié)合激活其表達(dá)。LlMYB4通過(guò)與LlPLATZ1互作拮抗其DNA結(jié)合能力，從而限制熱脅迫響應(yīng)，負(fù)調(diào)控百合耐熱性。該研究表明LlPLATZ1/LlMYB4-LlHSF24調(diào)控模塊在維持百合熱脅迫反應(yīng)平衡中發(fā)揮重要作用，使植物能夠適應(yīng)復(fù)雜的環(huán)境變化。

百合(Lilium spp.)是全球重要的園藝作物，對(duì)高溫特別敏感，是研究耐熱性的理想植物(Bakery et al. 2024; Wu, Gong, Zhang, et al. 2024; Gong et al. 2025; Xiang et al. 2025; Wu et al. 2026)。因此，闡明百合熱脅迫響應(yīng)機(jī)制并鑒定其中的關(guān)鍵基因，對(duì)于利用分子技術(shù)提高百合耐熱性至關(guān)重要。PLATZ (PLANT A/T-RICH SEQUENCE - and ZINCBINDING PROTEIN)轉(zhuǎn)錄因子家族是一類(lèi)植物特有的、鋅依賴(lài)的DNA結(jié)合蛋白。該家族的特點(diǎn)是能夠非特異性地結(jié)合富含A/T的DNA序列。最近的研究強(qiáng)調(diào)了PLATZ轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)鹽和干旱脅迫中的重要作用(Feng et al.2024)。但PLATZs關(guān)于熱脅迫響應(yīng)的研究仍不清楚。HSF（熱激轉(zhuǎn)錄因子）是熱脅迫響應(yīng)的末端組分，直接調(diào)控植物中熱保護(hù)基因的表達(dá)。之前的研究主要集中在百合中A類(lèi)HSF介導(dǎo)的熱信號(hào)途徑，然而對(duì)其他類(lèi)型HSF的研究缺乏，其上游調(diào)控機(jī)制仍知之甚少。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院百合科研團(tuán)隊(duì)解析了LlPLATZ1/LlMYB4-LlHSF24調(diào)控模塊在維持百合平衡的熱脅迫反應(yīng)的機(jī)制，填補(bǔ)了PLATZ轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物耐熱性的空白。

LlPLATZ1是一個(gè)熱誘導(dǎo)的PLATZ轉(zhuǎn)錄因子。在百合葉片中的表達(dá)分析表明，LlPLATZ1在熱脅迫處理后0.5 h即被快速誘導(dǎo)表達(dá)，在1 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值，表明LlPLATZ1受高溫瞬時(shí)激活。作者分離了LlPLATZ1的啟動(dòng)子區(qū)域，分析了其在高溫條件下的活性。將LlPLATZ1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Luc報(bào)告基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)化為煙草葉片。熱脅迫后，Luc活性顯著升高。此外，作者將LlPLATZ1-GUS瞬時(shí)轉(zhuǎn)化為百合花瓣。與正常條件相比，高溫脅迫處理增強(qiáng)了GUS的強(qiáng)度，表明高溫促進(jìn)了LlPLATZ1啟動(dòng)子的活性。在熱脅迫條件下，GUS活性顯著高于對(duì)照條件，表明熱脅迫激活LlPLATZ1啟動(dòng)子活性。根據(jù)這些結(jié)果，推斷LlPLATZ1是一個(gè)熱誘導(dǎo)的PLATZ轉(zhuǎn)錄因子。

LlPLATZ1作為轉(zhuǎn)錄抑制因子發(fā)揮作用。在正?；驘崦{迫條件下，LlPLATZ1均定位于細(xì)胞核。此外，熒光顯微鏡和免疫印跡分析表明，LlPLATZ1在短暫和長(zhǎng)期熱脅迫下積累。這些結(jié)果表明LlPLATZ1能夠在不同的熱脅迫條件下發(fā)揮作用。利用酵母實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)檢測(cè)了LlPLATZ1的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果顯示，LlPLATZ1轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞不能在缺素培養(yǎng)基(SD)上生長(zhǎng)，利用VP16報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化LlPLATZ1-VP16的酵母在缺素培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況弱于轉(zhuǎn)化VP16的酵母。這表明LlPLATZ1抑制了VP16的激活功能。此外，對(duì)轉(zhuǎn)化酵母中β-半乳糖苷酶活性的檢測(cè)表明，LlPLATZ1-VP16融合蛋白減弱了VP16對(duì)β-半乳糖苷酶表達(dá)的激活作用。這些結(jié)果表明LlPLATZ1在酵母細(xì)胞中作為轉(zhuǎn)錄抑制子發(fā)揮了重要的作用。此外，利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)在煙草葉片中檢測(cè)了LlPLATZ1在植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄能力。結(jié)果表明，與表達(dá)BD相比，BD-LlPLATZ1表達(dá)抑制了UAS驅(qū)動(dòng)的Luc報(bào)告基因的活性。同樣，在表達(dá)LlPLATZ1-VP16的區(qū)域，Luc信號(hào)弱于單獨(dú)表達(dá)VP16。這些結(jié)果表明LlPLATZ1在植物細(xì)胞中也顯示出轉(zhuǎn)錄抑制活性。

LlPLATZ1蛋白特性分析

LlPLATZ1直接結(jié)合LlHSF24的啟動(dòng)子并抑制其表達(dá)。在百合花瓣圓片中過(guò)表達(dá)LlPLATZ1進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。分析發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)LlPLATZ1導(dǎo)致891個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，765個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。其中，一個(gè)B類(lèi)HSF，LlHSF24，被觀(guān)察到顯著地下調(diào)表達(dá)。進(jìn)一步進(jìn)行表達(dá)分析，證實(shí)LlPLATZ1過(guò)表達(dá)抑制了百合中LlHSF24的積累。Y1H實(shí)驗(yàn)表明LlPLATZ1與LlHSF24啟動(dòng)子的A/T-rich片段特異性結(jié)合。EMSA表明，LlPLATZ1在體外與LlHSF24啟動(dòng)子富含A/T元件的標(biāo)記探針具有結(jié)合親和力。ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步提供了體內(nèi)LlPLATZ1與LlHSF24啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合的證據(jù)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明，與對(duì)照相比，在煙草葉片中瞬時(shí)過(guò)表達(dá)LlPLATZ1抑制了LlHSF24啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Luc活性。這些結(jié)果表明LlPLATZ1通過(guò)直接結(jié)合LlHSF24的啟動(dòng)子來(lái)抑制其表達(dá)。

LlPLATZ1結(jié)合LlHSF24的啟動(dòng)子并抑制其表達(dá)

LlPLATZ1賦予百合耐熱性。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化百合胚性愈傷組織間接再生的方式獲得了三個(gè)LlPLATZ1轉(zhuǎn)基因百合株系，隨后的生長(zhǎng)表型分析顯示過(guò)表達(dá)LlPLATZ1顯著限制了百合的生長(zhǎng)。表達(dá)分析表明，LlPLATZ1在這些轉(zhuǎn)基因株系中表達(dá)水平升高，而LlHSF24表達(dá)水平降低。熱脅迫后，LlPLATZ1轉(zhuǎn)基因組培幼苗的表型較野生型植株有所改善，具有較低的相對(duì)離子滲透率和較高的葉綠素積累。同時(shí)還檢測(cè)了盆栽轉(zhuǎn)化百合的耐熱性，經(jīng)熱脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出萎蔫和葉片褪綠現(xiàn)象減輕。轉(zhuǎn)基因植株葉片的相對(duì)離子滲透率受熱脅迫影響較小，其葉綠素含量減少也較低。DAB和NBT染色分析表明，熱脅迫后，轉(zhuǎn)基因株系積累了較低水平的ROS，表明過(guò)表達(dá)LlPLATZ1減輕了百合細(xì)胞熱誘導(dǎo)的損傷。

LlPLATZ1轉(zhuǎn)基因百合植株的耐熱性分析

采用VIGS方法沉默百合LlPLATZ1，表達(dá)分析表明，與野生型相比，沉默植株中LlPLATZ1的表達(dá)量降低，而LlHSF24的表達(dá)量升高，LlPLATZ1沉默植株在高溫脅迫后表現(xiàn)出更嚴(yán)重的葉片萎蔫和褪綠。與之一致的是，在熱脅迫條件下，沉默植株葉片中的相對(duì)離子滲透率高于野生型。高溫脅迫后沉默植株的葉綠素含量低于野生型。DAB和NBT染色分析表明，LlPLATZ1沉默植株在高溫脅迫后積累了更高水平的ROS。這些數(shù)據(jù)表明，LlPLATZ1沉默植株經(jīng)歷了更嚴(yán)重的熱脅迫誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。綜上所述，LlPLATZ1在百合耐熱性中發(fā)揮正調(diào)控作用。

VIGS介導(dǎo)的LlPLATZ1沉默百合植株耐熱性分析

LlHSF24負(fù)調(diào)控百合耐熱性。利用VIGS方法在百合植株中沉默LlHSF24。與TRV-control相比，沉默LlHSF24導(dǎo)致百合葉片在高溫脅迫后具有較低的相對(duì)離子滲漏和較高的葉綠素積累的耐熱表型。此外，高溫脅迫后，LlHSF24沉默植株葉片中ROS積累較少。熱保護(hù)基因LlHSP22.0和LlHSP70在LlHSF24沉默植株中上調(diào)表達(dá)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明LlHSF24抑制LlHSP22.0和LlHSP70啟動(dòng)子的活性，表明LlHSF24通過(guò)抑制熱保護(hù)基因發(fā)揮耐熱負(fù)調(diào)控作用。

VIGS介導(dǎo)的百合LlHSF24基因沉默植株的耐熱性分析

LlMYB4與LlPLATZ1蛋白互作。利用酵母雙雜交(Y2H)文庫(kù)篩選到LlPLATZ1的一個(gè)潛在互作蛋白MYB4。Y2H實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LlPLATZ1與LlMYB4存在互作。體外pull-down實(shí)驗(yàn)證明GST-LlPLATZ1蛋白與HIS-LlMYB4蛋白能夠結(jié)合，證實(shí)LlPLATZ1與LlMYB4是直接的物理互作。LCI分析顯示，在LlPLATZ1和LlMYB4共表達(dá)的煙草葉片區(qū)域有明顯的Luc信號(hào)，表明它們?cè)隗w內(nèi)也存在互作。BiFC分析表明，LlPLATZ1與LlMYB4的互作在正常和熱脅迫條件下均穩(wěn)定存在于細(xì)胞核中，與LlMYB4定位于細(xì)胞核中并積累的觀(guān)察結(jié)果一致。隨后，利用Co-IP技術(shù)分析高溫對(duì)煙草葉片中LlPLATZ1-LlMYB4互作的影響。結(jié)果顯示，熱脅迫處理并未影響LlPLATZ1和LlMYB4的蛋白積累；然而，在熱脅迫條件下，LlPLATZ1-LlMYB4的蛋白互作增強(qiáng)。這些結(jié)果表明，LlPLATZ1與LlMYB4蛋白互作，且高溫能夠促進(jìn)LlPLATZ1與LlMYB4的互作。

LlPLATZ1與LlMYB4互作

LlMYB4直接激活LlHSF24和拮抗LlPLATZ1的功能。表達(dá)分析表明，LlMYB4不受瞬時(shí)高溫的誘導(dǎo)，但受長(zhǎng)時(shí)間高溫的激活。Y1H實(shí)驗(yàn)表明LlMYB4能夠結(jié)合LlHSF24啟動(dòng)子。進(jìn)一步分析LlHSF24啟動(dòng)子，發(fā)現(xiàn)一個(gè)保守的MYB結(jié)合元件。EMSA證實(shí)LlMYB4在體外可以結(jié)合含有MYB結(jié)合元件的標(biāo)記探針。ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)LlMYB4在體內(nèi)結(jié)合到LlHSF24啟動(dòng)子上含有MYB結(jié)合元件的區(qū)域。在雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)中，LlPLATZ1對(duì)LlHSF24的啟動(dòng)子活性具有抑制作用，而LlMYB4對(duì)其活性具有激活作用；值得注意的是，LlPLATZ1和LlMYB4共表達(dá)導(dǎo)致抑制活性降低。這些結(jié)果表明，LlMYB4激活LlHSF24并與LlPLATZ1互作來(lái)調(diào)節(jié)其抑制作用。

 LlMYB4與LlHSF24的啟動(dòng)子結(jié)合并激活其表達(dá)

利用VIGS方法，在百合植株中沉默LlMYB4。LlMYB4沉默植株中LlHSF24表達(dá)量降低。與TRV-control相比，沉默LlMYB4導(dǎo)致百合葉片在高溫脅迫后具有較低的相對(duì)離子滲透率和較高的葉綠素積累的耐熱表型。值得注意的是，根據(jù)DAB和NBT染色實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，LlMYB4沉默的百合葉片積累了更少的ROS。這些結(jié)果表明LlMYB4負(fù)調(diào)控百合的耐熱性。利用百合花瓣瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行的LlPLATZ1和LlMYB4共表達(dá)和共沉默分析實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明LlPLATZ1和LlMYB4拮抗地調(diào)控百合耐熱性。

LlMYB4負(fù)調(diào)控百合的耐熱性

綜上所述，研究結(jié)果表明LlPLATZ1是一個(gè)新的耐熱正調(diào)控因子，在瞬時(shí)熱脅迫下，LlPLATZ1的表達(dá)被快速誘導(dǎo)。LlPLATZ1通過(guò)結(jié)合LlHSF24啟動(dòng)子直接抑制其表達(dá)，從而解除對(duì)HSP22.0和HSP70等熱保護(hù)基因的抑制，并激活熱脅迫響應(yīng)。在持續(xù)熱脅迫條件下，LlPLATZ1的熱誘導(dǎo)表達(dá)減弱，而LlMYB4積累并與LlPLATZ1互作，以拮抗性方式調(diào)控LlHSF24的表達(dá)，從而平衡熱脅迫響應(yīng)并維持百合的生長(zhǎng)。

LlPLATZ1/LlMYB4-LlHSF24模塊介導(dǎo)百合響應(yīng)高溫調(diào)控機(jī)制的工作模型

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院百合科研團(tuán)隊(duì)在讀碩士研究生龔雪，鐘山青年研究員向均博士，在讀碩士研究生廖紫微為論文共同第一作者，吳澤副教授和滕年軍教授為共同通訊作者。團(tuán)隊(duì)在讀博士生張?zhí)稹⒍±?、方倩倩參與了該研究工作。本研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金和江蘇省青年托舉工程項(xiàng)目的資助。

論文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.70572